Продуцирование видов реактивного кислорода и оксида азота (окислительная вспышка)
Продуцирование видов реактивного кислорода, вероятно, играет ключевую роль в защите растений. Часто это является первым откликом, активируемым при многих несовместимых взаимодействиях. Doke и соавторы (1983, 1988) были первыми, кто сообщил, что супероксидные анионы (O2∙ ─) продуцируются при несовместимых взаимодействиях, первоначально между картофелем и Phytophthora infestas, а затем между табаком и вирусом табачной мозаики. Генерируемый O2∙ ─ быстро дисмутирует либо неферментативно, либо через катализируемую супероксиддисмутазой реакцию до перекиси водорода HO2∙ + O2∙ ─ + Н+ ↔ Н2О2 + О2 либо 2O2∙ ─ + 2Н+ ↔ Н2О2 + О2, и таким образом у большинства растительных систем обнаруживается накопление H2О2. При кислом рН, таком, который наблюдается в клеточной стенке растения, период полужизни супероксида составляет <1 секунды. Поскольку H2О2 не имеет неспаренного электрона, она может пересекать биологические мембраны, что заряженные виды O2∙ ─ могут делать очень медленно. Как O2∙ ─, так и H2О2 имеют промежуточную степень реакционной способности, и клеточные повреждения, вызываемые реактивными видами кислорода (ROS) по-видимому обусловлены их превращением в более реактивные виды. Протонирование O2∙ ─, которое происходит более легко при низком рН, дает гидропероксильный радикал HO2∙. Поскольку HO2∙ является менее полярным, чем O2∙ ─, он может пересекать биологические мембраны примерно так же эффективно, как и H2О2. В отличие от O2, HO2∙ может непосредственно атаковать жирные кислоты, и, как показано, превращает линоленовую, линолевую и арахидоновую кислоты в перекиси липидов. Таким образом, при подходящих условиях, генерация O2∙ ─, приводящая к образованию HO2∙, может приводить к повреждению мембран и образованию массива потенциальных сигнальных молекул перекисей липидов.
В присутствии Fe2+, H2О2 может претерпевать реакцию Фентона {Fenton reaction}, которая приводит к появлению крайне деструктивного гидроксильного свободного радикала OH∙:
Fe3+ + O2∙ ─ → Fe2+ + O2 ;Fe2+ + H2О2 → OH∙ + OH– + O2
который может инициировать самопроизвольное перекисное окисление липидов. Если H2О2, входящая в цитоплазму клетки, сохраняется в достаточно высокой концентрации, чтобы достичь ядра растения или патогена, она может реагировать с внутриклеточными ионами металлов, образуя OH∙, который, как известно, фрагментирует ДНК сайт-специфической атакой. Таким образом, продуцирование ROS может приводить к значительному повреждению как хозяина, так и патогена и заставляет растительные клетки активировать массивы защитных механизмов.
В относительно недавних исследованиях с использованием культуры клеток растений было показано, что растения, вероятно, имеют механизм продуцирования O2∙ ─, в котором принимает участие NADPH-оксидаза, аналогичная той, которую используют нейтрофилы млекопитающих.
Однако клетки растений имеют еще два других пути генерации ROS. Во-первых, это белок оксалатоксидаза, которая может продуцировать H2О2 из щавелевой кислоты. Во-вторых, H2О2 могут продуцировать пероксидазы клеточной стенки.
Для ROS предполагается несколько ролей в защите растения. Например, H2О2 может непосредственно быть токсичной для микробов на уровнях, которые продуцируются в растениях. H2О2 также может вносить вклад в структурное упрочнение клеточных стенок растения; H2О2 необходима для образования предшественников лигниновых полимеров посредством активности пероксидазы и было показано, что обогащенные гидроксипролином и пролином гликопротеины клеточной стенки быстро окислительно сшивались в клеточных стенках после обработки грибным элиситором. Это поперечное сшивание белков также снижает «доступность протопласта», таким образом делает клеточную стенку растения более устойчивой к микробному проникновению и ферментативной деградации.
Также вероятна сигнальная роль для H2О2. H2О2 повышает ферментативную активность гидрокислазы бензойной кислоты, которая необходима для биосинтеза салициловой кислоты (SA). Кроме того, H2О2 активирует некоторые защитные механизмы, например, экспрессию гена глутатион-S-трансферазы, в смежных клетках.
Вероятно, генерация ROS будет приводить к изменению окислительно-восстановительного баланса в реагирующей клетке. У млекопитающих, многие факторы транскрипции, такие как ROS-отзывчивый фактор NF-kB, как известно, регулируются окислительно-восстановительным состоянием. Подобное может происходить и у растений. Имеются данные, которые наводят на мысль, что O2∙ ─ может быть одним из сигналов, который координирует индукцию генов защиты растения.
Оксид азота привлек значительный интерес фитопатологов благодаря установленной его роли в регуляции антимикробной защиты у млекопитающих, в частности через программируемую клеточную гибель (PCD).
NO действует как сигнальная молекула у видов всех биологических царств, эта особенность обусловлена его физическими свойствами, которые обеспечивают ему исключительно богатую химическую активность. NO высоко реактивный, благодаря присутствию неспаренного электрона, и подобно кислороду, он может существовать в виде ряда восстановленных состояний, –NO (нитроксильный ион, nitroxyl ion), NO и +NO (ион нитрозония, nitrosonium ion), и в каждом из них реактивные промежуточные соединения азота (reactive nitrogen intermediate (RNI)) способны осущетсвлять специфические взаимодействия. ·NO способен реагировать с атмосферным O2 с образованием NO2. Далее, NO является замечательно мобильной молекулой, способной легко пересекать мембраны, и, поскольку он мало растворим в водных растворах, он легко переходит в газообразную фазу. Это заметно повышает его потенциал как сигнальной молекулы.
В биологических системах, NO вмешивается в пути передачи сигналов посредством целого ряда действий. Многие эффекты NO обусловлены окислительным повреждением, связанным с образованием потенциального оксиданта пероксинитрата через взаимодействие с суперокисидом (NO + O2– → –ONOO). Менее жестким действием является электрофильная атака со стороны ·NO тиоловых групп, в частности остатков цистеина, что приводит к S-нитрозилированию молекул, таких как глутатион или белки. S-нитрозилирование может модулировать активность белка; например, мономерной связывающий GTP белок, p21ras, активируется S-нитрозилированием, тогда как, в противоположность этому, киназа JNK1 при этом инактивируется.
Альтернативно NO может модифицировать белки посредством нитрирования, в частности остатков тирозина. Сродство NO к переходным металлам (например Fe2+/Fe3+), приводит к формированию комплексов железо-нитрозил; такое взаимодействие также используется для регуляции биологической активности. Это взаимодействие является центральным в классическом пути передачи сигналов, в котором NO связывается с группами гема растворимой и ассоциированной с мембраной гуанилилциклазы, что приводит к изменению конфигурации и активации энзиматической продукции cGMP из GTP. Увеличение уровня cGMP повышает активность киназы (NO-G-kinase) и фосфодиэстразы, которые влияют на регуляцию cGMP ионных каналов. Одной из хорошо документированных целей NO-G-киназы является легкая цепь миозина.
Другое важное взаимодействие включает связывание NO с группами гема в пределах ферментов P450, и это ингибирует их активность. Особенно интересным является взаимодействие NO с гемоглобином (Hb), поскольку этот комплекс имеет способность доставлять, запасать и окислять (детоксифицированть) NO. Гемоглобины растений, как было показано, реагируют с NO с образованием NO3 при аэробных условиях в двустадийном процессе. На первой стадии, NO окисляет гем с образованием метагемоглобина, из которого NO3 высвобождается после восстановления редуктазой, содержащей NADPH или флавин. Этот путь представляет механизм, посредством которого уровни NO быстро изменяются в биологических системах.
NO/пероксинитрит может также обратимо нарушать активность ферментов, содержащих в активном центре железо и серу (4Fe-4S), что приводит к потере железа ([4Fe-4S]2++ONOO– + H+ → [3Fe-4S]+ + NO– + ·NO2 + Fe2+), которая затрагивает энзиматическую активность. Хорошо охарактеризованными целями в подобном случае является фермент цикла Кребса аконитаза, которая катализирует изомеризацию цитрата в изоцитрат, и комплексы I и II в электрон-транспортной цепи. Таким образом, взаимодействие NO/белок 4Fe-4S будет усиливать окислительный стресс посредством нарушения функций митохондрий и посредством способствованию образованию реактивного гидроксильного радикала через реакцию Фентона (Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + HO– + ·HO).
В биологических системах, NO может генерироваться ферментативным путем и неферментативно. Наиболее хорошо описанными ферментами, продуцирующими NO, явлюется синтаза оксида азота (NOS) и нитратредуктаза (NR). NOS катализирует двухстадийное окисление L-аргинина в NO и цитруллин (L-аргинин + NADPH2 + O2 → Nω-гидроксиаргинин → + NADPH2 + O2 → L-цитруллин + NO); данная реакция может также катализироваться цитохромом P450. NR генерирует NO из нитрита с использованием NADPH в качестве донора электронов.
Несмотря на идентификацию гена NOS растений, очевидные доказательства показывают, что растения могут продуцировать ·NO из нитрита с помощью NADPH-зависимой нитратредуктазы (NO3 → NO2 → ·NO + O2). Использование высоких уровней нитратов при условиях аноксии увеличивает продуцирование NO. Также допускается, что NO у растений может образовываться посредством неферментативного восстановления нитрита (2NO2 + 2H+ ↔ 2HNO2 → NO + NO2 + H2O), этой реакции благоприятствуют кислые условия, подобные тем, которые обнаруживаются в апопласте алейронового слоя ячменя.