Механизм биологической фиксации молекулярного азота

Атомы в молекуле азота (N₂) соединены тремя ковалентными связями, энергия диссоциации которых равна 9,4 • 10⁵ дж/молъ. Наибольшей энергией — 5,3•10⁵ дж/молъ — обладает первая связь, вторая — 2,5•10⁵ дж/молъ, третья — 1,6 • 10⁵дж/молъ. Эти связи очень прочны, в связи, с чем молекулы азота химически инертны. Именно инертность азота обусловливает необходимость его активации, так же как и повышения химической активности вступающего с ним в реакцию соединения или элемента.

Синтез аммиака из атмосферного азота химическим путем, осуществляемый методом Габера — Боша, происходит при температуре 400 — 500 °С и высоком давлении (200-1000 атм). Клетки микроорганизмов проводят процесс азотфиксации в обычных условиях. У азотфиксаторов, как показал В. Л. Кретович, интенсивность энергии обмена, в частности степень потребления кислорода, значительно выше, чем у бактерий, неспособных фиксировать азот. Также у них более активны ферменты. Однако, каким путем эта энергия используется в процессе азотфиксации, до настоящего времени еще точно не установлено.

В современных гипотетических схемах механизма азотфиксации несомненное предпочтение отдается восстановительному характеру превращений молекулярного азота, о чем в 20-е годы этого столетия утверждали С. П. Костычев и С. Н. Виноградский, выдвигая «аммиачную теорию» фиксации атмосферного азота. У всех свободноживущих азотфиксирующих микроорганизмов, а также и при симбиотической азотфиксации аммиак (NH₃) обнаружен в качестве первого стабильного продукта этого процесса.

Наиболее вероятно, что разрыв связей в молекуле азота происходит не сразу, а последовательно, в результате действия ферментных систем. В. Е.Шилов и Г.И.Лихтенштейн (1971) предложили механизм активации азота ферментом нитрогеназой. Молекулярный азот через щель размером 4-5 ангстрем, что соответствует длине молекулы азота, поступает внутрь фермента и здесь активируется. В его активации большая роль принадлежит молибдено- и железосодержащим центрам, по цепям атомов которых происходит эстафетная передача активирующих азот электронов от восстановителя. Реакции активации способствует близость группировок серы.

В результате активации и хемосорбции азота нитрогеназой высвобождается энергия и происходит разрыв двух связей в молекуле азота. На это расходуется 7,8*10⁵дж/моль. Третья связь разрывается при внедрении в молекулу активированного азота: водорода, активированного, в свою очередь, ферментами дегидрогеназной и гидрогеназной систем. Получающийся аммиак или другие восстановленные продукты азота реагируют с кетокислотами, образуя аминокислоты.

В.С. Шевелуха с соавторами приводят следующую схему нитрогеназной активности, сопровождающей фиксацию азота – рисунок .46. На схеме показано, что он состоит из трех типов белков (α, β и γ) и двух кофакторов: молибден-железо-(MoFe)-содержащего и железо (Fe)-содержащего. Нитрогеназа состоит из двух субъединиц: большой — динитрогеназы, в состав которой входит MoFe-кофактор (которую также называют компонентом 11) и малой – редуктазы динитрогеназы, содержащей Fe-кофактор (компонент 1).

Восстановление молекул азота происходит при ее взаимодействии с MoFe-кофактором (см. рисунок 45), то есть на динитрогеназе. Функция редуктазы заключается в передаче электронов на динитрогеназу. Ионы железа входят в состав обоих компонентов в геминовой (редуктаза динитрогеназы) или негеминовой (динитрогеназа) формах.

Несмотря на сложность структуры, нитрогеназа обладает низкой субстратной специфичностью: она способна восстанавливать широкий спектр соединений с тройной связью, в том числе превращать ацетилен в этилен. Суммарная реакция, катализируема нитрогеназой, выражается уравнением:

N₂ + 8H⁺ + 8e^— + 16ATФ = 2NH₃ + H₃ + 16АДФ +16Ф_н

Большое количество молекул АТФ, необходимых для реакции, показывает ее высокую энергоемкость, которая гораздо выше, если учесть энергетические затраты на синтез нитрогеназы и обслуживающих ее ферментов. Подсчитано, что для фиксации 1 г азота необходимо затратить 100-200 г глюкозы, поэтому понятно, что азотфиксация будет происходить при дефиците доступных форм азота и достаточных источниках энергии.

nif H – ген, кодирующий структуру γ-белков нитрогеназы; nif K– ген, кодирующий структуру β -белков нитрогеназы; nif D – ген, кодирующий структуру α -белков нитрогеназы.

Рисунок 46 — Структура и функции нитрогеназы (по В.С. Шевелуха с соавт)

Наиболее эффективным источником энергии для микроорганизмов являются окислительное фосфорилирование и фотосинтез. Однако нитрогеназа очень чувствительна к свободному кислороду и необратимо инактивируется даже при небольших концентрациях кислорода, что затрудняет сопряжение аэробных энергетических процессов и фиксации азота. Поэтому у микроорганизмов-азотфиксаторов появились различные механизмы, позволяющие решать эту проблему. У свободноживущих диазотрофов это достигается либо тем, что гены, кодирующие нитрогеназу, активизируются только в анаэробных условиях или микроаэрофильных условиях (свободноживущие эубактерии, архебактерии), либо тем, что азотфиксирующие клетки образуют плотную оболочку, которая очень медленно пропускает кислород (гетероцисты цианобактерий). В симбиотических системах, функцию защиты нитрогеназы от кислорода выполняет, как правило, хозяин.

Синтез и созревание нитрогеназы кодируется сложной системой

nif-генов, многие из которых являются общими для всех азотфиксаторов. У наиболее изученного из них – энтеробактерии Klebsiella pneumoniae – эта система включает 25 генов, собранных в единый кластер и организованных в семь транскрипционных единиц. Гены nif H, nif D, nif K кодируют структуру γ-, α- и β-белков нитрогеназы; гены nifМ, nifS, nifU, nifY – процессинг этих белков. Специальная группа генов – nifВ, nifЕ, nifN, nifV – контролирует синтез MoFe-кофактора. Помимо генов, кодирующих структуру компонентов нитрогеназного комплекса, nif — оперон Klebsiella содержит два регуляторных гена, nifА кодирует белок, активирующий транскрипцию генов nifHDK и других nif-генов, а продукты nif гена nifL репрессируют транскрипцию nif-генов в присутствии кислорода или связанного азота. У многих азотфиксаторов nifL отсутствует, и его функцию выполняют другие гены.