Оптимизация питательной среды
Оптимизировать этап микрочеренкования пробирочных растений можно применением электромагнитного облучения (ЭМИ) низкой интенсивности (СВЧ-лучи), растительной добавки из размолотых в порошок семян винограда, введением в питательную среду 6-БАП в количестве 0,05 мг/л.
Электромагнитное облучение оказывает положительное влияние на образование и рост корней у пробирочных растений, на среднесуточную скорость роста их, способствующую увеличению длины, массы побегов, увеличению числа узлов на побег в 1,4 раза. Благодаря этому, можно сократить период культивирования до 50-60 дней, чаще проводить субкультивирование и тем самым повысить эффективность клонального микроразмножения винограда при высоком качестве микрочеренков.
Обоснованием для применения растительной добавки из семян винограда является наличие в их экстракте антиоксиданта пикногенола и веществ с ценными биологическими свойствами, в частности цитокининов, ауксинов, рутинов и т.д. Добавление тонко размолотых семян винограда в питательную среду при микрочеренковании побегов способствует увеличению числа корней и их массы, улучшению роста побегов, образованию большего числа листьев и новых узлов, улучшению развития листовой поверхности, увеличению общей массы побегов. Эффективность микроразмножения увеличивается при этом на 27,4 %.
Следующий способ оптимизации питательной среды основан на способности 6-БАП индуцировать клеточное деление, растяжение клеток листьев, задерживать старение путем стимуляции процессов биосинтеза. Этот регулятор роста, добавленный в питательную среду на этапе микрочеренкования в количестве 0,05мг/л, обеспечивает оптимальное соотношение между длиной корней и побегов. Кроме этого, он стимулирует рост побегов, образование более крупных листьев, увеличение массы растений, закладку большего числа узлов, повышение жизнеспособности растений, что, в конечном итоге, повышает выход микрочеренков более чем в два раза.
Результаты изучения фитогормона эмистим указывают на то, что этот препарат положительно влияет на рост меристематических тканей, процессы роста пробирочных растений, снижает влияние неблагоприятных и стрессовых факторов, повышает устойчивость к патогенам. Производственная проверка, проведенная на сорте Каберне северный, показала, что благодаря эмистиму улучшается адаптация пробирочных растений к нестерильным условиям до 95-100%.
Процесс адаптации пробирочных растений к не стерильным условиям является ответственной и трудоемкой операцией. Это связано с тем, что у пробирочных растений нарушена деятельность устьичного аппарата, вследствие чего они подвержены очень быстрому обезвоживанию.
Способ адаптации оздоровленных пробирочных растений винограда к не стерильным условиям включает выбор субстрата, отбор растений определенных размеров, обработку растений и субстратов, осуществление процесса адаптации на стеллажах ускоренного размножения растений (СУВР).
Лучшие результаты получены на субстрате торф: песок: почва = 1:1:1 с добавлением натурального цеолита. Оптимальный размер пробирочных растений:3-5 листьев и 2-3 корня длиной 1,5-3 см. Для предотвращения инфицирования необходима обработка их раствором марганцовокислого калия, для улучшения ризогенеза индолилуксусной кислотой. Растения, высаженные в торфоперегнойные горшочки и помещенные в закрытые полиэтиленовые пакеты, культивируют на стеллажах ускоренного размножения растений при температуре 25-270С, освещенности 8-10 тыс. люкс и световом периоде 16 часов.
В системе безвирусного питомниководства обязательно тестирование растений на наличие вирусов.Основные методы диагностики, применяемые в настоящее время при получении безвирусных клонов винограда: визуаль ный, травянистых индикаторов, индексация прививкой на индикаторных сортах, метод иммунно-ферментного анализа (ELISA- тест), методы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Визуальный метод является основным на начальных этапах оздоровления от вирусов. Он основан на том, что многие вирусные болезни вызывают у пораженных кустов только им свойственные симптомы. Листовые деформации, нарушение морфогинеза побегов, мозаичные пятна или полосы хлоротичной желтой окраски характерны для штаммов вируса короткоузлия. Для практики самым важным симптомом короткоузлия, проявляющегося на гроздях, является осыпание и горошение ягод.
Однако внешние симптомы не всегда являются признаками вирусных инфекций. Такие симптомы могут возникнуть под действием гербицидов группы 2,4 Д. Вирусоподобные симптомы могут развиваться от недостатка минерального питания, наличия в почве токсических веществ, значительного повреждения корней филлоксерой и нематодами, из-за неблагоприятных климатических условий. Симптомы, сходные с симптомами вирусных болезней, вызывает паутинный клещик (Phyllocoptes vitis). При повреждении винограда другим клещом (Tetranychus urtica) также появляются симптомы вирусных заболеваний.
Для быстрого выявления растений винограда, пораженных сокопереносимыми вирусами (вирусы короткоузлия, желтой мозаики окаймления жилок, арабис – мозаики, табачной мозаики, кольцевой пятнистости малины и т.д.) применяется тестирование на травянистых индикаторах, в качестве которых можно использовать растения Cucumis sativus с добавлением в инокулюм для предотвращения ингибирования вирусов тиосульфата натрия с активированным углем.
Для определения латентных вирусных инфекций применяют метод индексации прививкой на индикаторных сортах винограда: Рупестрис дю Ло, ЛН-33, Пино черный, Рупестрис х Берландиери 110 Рихтера, Рипария Глуар де Монпелье. Заражение индикаторов проводят методом настольных или зеленых прививок в теплице.
ПЦР — самый чувствительный среди методов определения биологических объектов, включая вирусы, бактерии, грибы и т. д. Его недостатки – жесткие требования к подготовке образца, необходимость доказательства специфичности продукта.
Все рассмотренные методы могут и должны использоваться как взаимодополняющие, не существует «наилучшего метода» для всех случаев. Для выявления зараженных сортообразцов первичный скрининг выгодно проводить более дешевыми биологическими методами (визуальный метод, метод травянистых индикаторов, тестирование на сортах индикаторах). В условиях применения биотехнологических методов ускоренного размножения единственная меристемная линия может быть использована в питомниководстве целых регионов страны. Поэтому при формировании оздоровленных генобанков винограда нужны методы, позволяющие определить даже одну молекулу патогена в пробе, что можно сделать с помощью методов на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Если пребазовый материал накапливается в теплицах, то базовый используется для закладки базисных маточников.
Закладка маточников базового посадочного материала включает:
— выбор участка и подготовку его к закладке маточника,
— создание комплекса из нескольких пленочных или стационарных теплиц и прилегающего к ним участка земли,
— выбор способа закладки маточника,
— оптимальные и допустимые способы закладки маточника,
— уход за маточными насаждениями,
-.осуществление фитосанитарного контроля над состоянием маточника.
Базисные маточники могут быть заложены на участках, удаленных от рядовых насаждений винограда на расстояние не менее 1000м. Во избежание вторичного заражения, их высаживают в почву, свободную от нематод – переносчиков и возбудителя бактериального рака. Таковыми считаются почвы, на которых в течение 10-12 лет не выращивался виноград, а последние 3-5 лет выращивались зерновые культуры.
Разработаны следующие способы закладки маточника:
— высадка растений в пленочную теплицу на постоянное место по схеме посадки 1,5-2,0 м х 0,4 м, с последующим содержанием маточника под пленкой или вегетированием растений на открытом воздухе;
— высадка растений в пленочную теплицу по схеме 40 х 30 см с последующей выкопкой полученных саженцев, хранением их и высадкой в открытый грунт;
— закладка маточников в стационарной теплице в два этапа:в первый год растения, полученные in vitro , высаживают по уплотненной схеме (30 х 15 см) в теплице или в открытом грунте, а затем пересаживают в теплицу по га.;
— высадка растений в открытый грунт с предварительной закалкой их.
При посадке более высокая приживаемость отмечена у растений высотой 20-30 см с 5-6-ью настоящими листьями. Определены оптимальные (первая декада июня) и допустимые (третья декада мая – вторая декада июня) сроки посадки.
При соблюдении всех условий закладки маточников наблюдается высокая приживаемость саженцев (80,0-90,0%), хорошее развитие растений (177,6-184,1см) и вызревание(109,1-138,7см) побегов при диаметре 0,5 см, то есть за один год можно создать маточник, а в следующем году уже приступить к заготовке лозы.
Выращивание сертифицированного оздоровленного in vitro , базового посадочного материала позволяет не только избавится от ряда микоплазменных и вирусных заболеваний, но и от сосущих вредителей, таких как филлоксера и виноградный зудень. Уменьшается также вероятность присутствия на маточных растениях возбудителей эски, эутипоза и черного рака, то есть возбудителей, входящих в группу хронических вредных организмов
Основу базового посадочного материала составляют растения, которые в силу генетического потенциала, отсутствия латентной инфекции обладают преимуществами в росте, развитии, толерантности к неблагоприятным условиям внешней среды, в выходе стандартных черенков и урожайности по сравнению с исходными проверяемыми растениями. Благодаря этому переход на закладку промышленных насаждений сертифицированным посадочным материалом, обеспечивает повышение продуктивности виноградников и продление их продуктивной эксплуатации.В случае предохранения от вторичного заражения возбудителями хронических болезней реально увеличить продуктивность будущих насаждений в 1,5-2 раза..