Разбавление, хранение и транспортировка спермы

Чтобы увеличить объем эякулята, а также для того, чтобы сохранить оплодотворяющую спо­собность спермиев на более длительный срок, при хранении их вне организ­ма сперму разбавляют специальными средами.

Для сохранения спермы вне организма нужно создавать условия, кото­рые тормозили бы расходование внутренних запасов в спермиях и не вызы­вали их гибель.

Синтетическая среда обычно состоит из трех компонентов. В состав среды для спермы быка входят:

Сахара (глюкоза, лактоза) — служат источником энергии для спермиев. Помимо этого они участвуют в поддержании осмотического давления, пони­жают электропроводность среды, предохраняют спермии от потерь электри­ческого заряда. С желтком куриного яйца образуют биокомплексы, защи­щающие мембрану спермиев от повреждений при охлаждении.

Цитрат натрия. Создает буферность среды, нейтрализует конечные про­дукты жизнедеятельности спермиев, связывая ионы кальция и тяжелых ме­таллов, обеспечивает снижение их уровня до оптимального.

Глицерин. Защитное действие глицерина связано с понижением точки замерзания растворов. Глицерин задерживает начало кристаллизации (основ­ной причины гибели клеток при замораживании), замедляет рост кристаллов, снижает осмотическое давление растворенных веществ при замораживании до эвтектической точки (-46,5⁰С). Глицерин всегда находится в жидкой фазе раствора, вследствие чего концентрация осмотически активных веществ уменьшается, что и способствует сохранению клеток.

Желток куриных яиц. Содержит лецитин и липопротеины. Они создают на поверхности спермиев адсорбционный слой, предохраняющий спермии от холодового шока, который подстерегает спермии до температуры — 51⁰С, то есть пока в сперме сохраняется жидкая фаза.

Спермосан ППК. Комплексный антибактериальный препарат, состоя­щий из пенициллина, полимиксина, канамицина. Такая комбинация эффек­тивно тормозит размножение микроорганизмов в сперме.

Для разбавления и кратковременного хранения спермы быка при темпе­ратуре +2-5⁰С необходимы следующие компоненты: вода дистиллированная — 100 мл, глюкоза — 3 г, натрий лимоннокислый, трехзамещенный, пятивод-ный — 1,4 г, желток куриного яйца — 12 мл, спермосан ППК — 75000 ИЕ.

С момента получения спермы от производителя до разбавления должно пройти не более 10 мин. В зависимости от подвижности и концентрации спермиев сперму быка разбавляют так, чтобы в одной дозе при всех способах хранения перед осеменением было 10-15 млн. спермиев с прямолинейно-поступательным движением. Сперму быков, сохраненную при температуре +2-5⁰С, используют для осеменения коров и телок в течение 3 суток с актив­ностью спермиев не ниже 7 баллов, а после хранения в замороженном со­стоянии — не ниже 4 баллов.

Температура синтетической среды перед разбавлением спермы должна быть одинаковой со спермой (27-35°С). Среду осторожно приливают к спер­ме, соблюдая правила асептики.

Для разбавления и замораживания спермы быка в форме гранул (капе­лек) применяют лактозо-желточную среду следующего состава: вода дистил­лированная — 100 мл, лактоза — 11,5 г, желток куриного яйца — 20 мл, глице­рин — 5 мл.

Разбавляют сперму одномоментно, так чтобы в одной грануле (0,2 мл) после оттаивания содержалось не менее 15 млн. подвижных спермиев. Раз­бавленную сперму (температура 31±1,8°С) охлаждают при 2-5°С в течение 4 ч и замораживают на фторопластовых пластинках с лунками в специальных емкостях, заполненных жидким азотом. Наносят сперму на охлажденную пластину с помощью охлажденных шприцев или полиэтиленовой капельни­цы. После выдержки пластины в течение 1-2 мин над жидким азотом и затем в жидком азоте пластину поднимают до верхнего уровня емкости, охлажден­ной лопаткой сгребают гранулы в охлажденный контейнер или марлевый мешочек и переносят на хранение в специальное хранилище (КВ-620 и др.) емкостью 100-200 тыс. доз.

Более чем сорокалетний опыт применения в нашей стране заморажи­вания спермы в форме гранул наряду с несомненными достоинствами (про­стота, рациональное использование криогенного оборудования) имеет и не­достатки:

1. Большая доля низкопроизводительного труда при осуществлении ос­новных технологических операций.

2. Отсутствие маркировки необлицованных гранул спермы.

3. Прямой контакт с хладагентом (жидким азотом) при хранении гранул спермы в марлевых мешочках, приводит к адсорбции на поверхности гранул микроорганизмов и механических примесей.

Для устранения этих недостатков в нашей стране был разработан метод замораживания спермы в облицованных гранулах. Сущность его заключается в том, что разбавленной спермой заполняют топкую полимерную трубку, за­тем с помощью автоматического устройства ее делят на спермодозы с одно­временной герметизацией и маркировкой.

В 1975 г. Р. Кассу (Франция) для расфасовки спермы при замораживании впервые применил соломинки из полипропилена (пайеты) емкостью 0,5 мл. На бейсогальской станции искусственного осеменения (Литва) в 1981 г. вве­дена была в эксплуатацию технологическая линия по замораживанию спермы быков в полипропиленовых соломинках отечественного производства емко­стью 0,25 мл. Расфасовку проводят на специальной машине, которая автома­тически наполняет соломинки спермой и укупоривает стеклянными шарика­ми. Соломинки ставят в штативы по 30 штук и заключают в пластмассовые пеналы: их выдерживают 4 часа при температуре 4-5⁰ С, а затем переносят в газообразный азот (температура – 140⁰С) на 3 мин. для замораживания.

Эта методика наиболее перспективна. Она позволяет достичь высокой степени асептизации, механизации и автоматизации на всех этапах техноло­гической обработки спермы, перевести замораживание спермы на промыш­ленную основу. Криоконсервация спермы в пайетах устраняет недостатки в технологии, присущие изготовлению как необлицованных, так и облицован­ных гранул, а также исключает потери спермы при оттаивании и осеменении самок.

Сперму, сохраняемую при 2-5°С, фасуют в одноразовые стерильные по­лиэтиленовые ампулы, полиэтиленовые пробирки объемом по 1 мл или во флаконы из-под антибиотиков. Полиэтиленовые ампулы запаивают, а про­бирки и флаконы закрывают стерильной нетоксичной пробкой и закрепляют ее резиновым кольцом. Сперму быка перевозят и хранят в широкогорлых пищевых или пластмассовых термосах.

Замороженную сперму перевозят и хранят в сосудах Дыюара марки СДС-50, СДС-20, СДС-5 и др. Эти сосуды представляют собой стальные или алюминиевые двустенные емкости с вакуумно-порошковой либо многослой­но вакуумной изоляцией.

Вместимость их варьирует от 5 до 50 л, суточный расход жидкого азота колеблется от 1 до 3% в зависимости от размеров сосу­дов и качества изоляции. Периодически сосуды пополняют жидким азотом. Азот доставляют на пункты искусственного осеменения в транспортных резервуарах на автомобилях — азотовозах.

Сохраняемая сперма должна быть полностью покрыта жидким азотом. Только в этом случае гарантируется сохранение оплодотворяющей способно­сти спермы в течение длительного времени. Установлено, что при подъеме канистр более чем на 10 см от уровня жидкого азота, температура сохраняе­мой спермы поднимается до -50-60⁰С, а процессы рескристаллизации (обра­зование кристаллов при оттаивании), начинаются уже при температуре ми­нус 120-140°С, что ведет к снижению качества спермы. По этой же причине при перекладывании спермы из сосуда в сосуд нельзя держать емкости со спермой вне азота более 5-10 сек.