Хранение эмбрионов

После оценки на жизнеспособность эмбрионы дважды промывают в фосфатном буфере Дюльбекко с добавлением анти­биотиков, засасывают в мини пайету вместе с небольшим количеством сре­ды. Для пересадки используют в течение 2-4 часов после извлечения из поло­вых путей донора.

Существуют несколько способов хранения эмбрионов: кратковременное вне организма, кратковременное в организме, долговременное в сжиженных газах.

При разработке способа кратковременного хранения эмбрионов вне ор­ганизма был использован опыт культивирования тканей и клеток. Наиболее подходящей средой для культивирования эмбрионов оказалась ТСМ 199 с добавлением 20%-ной эмбриональной сыворотки или сыворотки крови оле­ней. Эмбрионы хранят в атмосфере обогащенной углекислым газом, при постоянной температуре 37°С. В таких условиях они остаются жизнеспособными в течение 24-48 ч.

Для кратковременного хранения, интерес представляет помещение эм­брионов в половые пути крольчих, с последующей их трансплантацией.

После пребывания в этих условиях в течение 3-4 дней сохранили жизне­способность 75% эмбрионов коров и 16% эмбрионов свиней.

В 1947 году советским ученым И.И. Соколовской, И.В. Смирнову и В.К. Милованову впервые в мире удалось получить потомство у животных, при осеменении спермой подвергнутой замораживанию до -20-40°С. Родились нормальные жизнеспособные крольчата. Через три года этими же учеными были получены 66 крольчат, 11 телят и 5 ягнят от спермы, хранившейся в жидком азоте (- 196°С). В то же время аналогичные опыты проводились в Англии. Эти работы явились поворотной вехой в животноводстве. Они от­крыли совершенно новые возможности сохранять генофонды ценных живот­ных-производителей, транспортировать сперму на какие угодно большие расстояния. Интенсивное животноводство сегодня немыслимо без консерва­ции генетического материала.

Дальнейшие исследования показали, что в жидком азоте можно сохра­нить не только живые клетки растений и животных, но также зародыши на ранних стадиях их развития. В 1972 г. удалось разработать метод заморажи­вания эмбрионов млекопитающих (мышей). Глубокое замораживание эм­брионов крупного рогатого скота впервые осуществили Уилраден, Полдж и Раусон в 1978 г. Предложенная ими техника в последствии была усовершенст­вована Лейбо (1984). В нашей стране работы по криоконсервации эмбрионов были начаты в 1979 г. 12 марта 1980 г. в лаборатории трансплантации эм­брионов крупного рогатого скота Всесоюзного института животноводства был получен теленок от пересадки замороженного эмбриона. После замора­живания и трехсуточного хранения в жидком азоте эмбрион был оттаян и пе­ресажен телке-реципиенту, от которой и родился бычок, по кличке Заморо­женный с массой тела 45 кг.

При внедрении в практику криоконсервации эмбрионов отпадает необ­ходимость синхронизации охоты или содержания большого количества ре­ципиентов для однодневной пересадки, появляется возможность отделить процесс получения эмбрионов от собственно трансплантации. В таких стра­нах, как Франция, США и Канада, до половины получаемых зародышей в на­стоящее время подвергается криоконсервации.

Данный метод позволяет создавать банки эмбрионов и яйцеклеток особо ценных и редко встречающихся, а также находящихся под угрозой исчезно­вения животных. По данным К.И. Сергеева и др. (1991) в мире насчитывается более 1000 пород крупного рогатого скота. Хранение в замороженном со­стоянии позволит значительно снизить затраты на сохранение этого гено­фонда и распространение по всему земному шару пород животных с оценен­ным генетическим кодом.

В настоящее время применяется два способа глубокого замораживания эмбрионов: в программированном режиме (ступенчатое охлаждение) и одно­моментный (витрификация).

При замораживании по первому способу отобранные эмбрионы после­довательно проходят через растворы криопротектора (глицерин или диме-тилсульфоксид) возрастающих концентраций, приготовленные на фосфатно-буферном солевом растворе Дюльбекко с добавлением 20%-ной фетальной сыворотки теленка. После этого эмбрионы переносят в пробирки или ампулы (по 1-4 в каждую) вместе с 0,3-0,4 мл среды с криопротектором.

Емкости с эмбрионами герметизируют (пробирки закрывают фольгой, ампулы запаивают) и помещают в камеру замораживателя, где охлаждают до -7°С в режиме 1°С/мин. После достижения указанной температуры вызывают кристаллизацию среды. Для этого в жидком азоте пинцетом касаются стенки пробирки (ампулы) в зоне «верхнего края столбика среды.

Дальнейшее охлаждение (до -28° или -35°С) ведут со скоростью 0,5°С/мин, затем скорость уменьшают до 0,1°С/мин; через 10 мин доводят до конечной температуры погружением в жидкий азот /-196°С/.

Одномоментное замораживание (витрификацию) впервые описал А. Массип в 1987 г. Установлено, что эмбрион, который на 20% состоит из твердых составных частей и на 80% из воды, подвержен двум негативным влияниям — образованию интрацеллюлярных кристаллов и воздействию высо­ких концентраций солей, что ведет к его гибели .Чтобы предотвратить гибель эмбрионов применяют высокую концентрацию криопротектора и быструю скорость охлаждения.

Замораживают быстрым методом в мини пайетах емкостью 0,25 мл. В пайету последовательно засасывают 0,5 М раствор сахарозы, воздух, 1,0 М раствор глицерина с эмбрионом, воздух, 0,5 М раствор сахарозы / для приго­товления 0,5 М раствора сахарозы в 1 л ФСБ — фосфатно-солевом буфере рас­творяют 171 г сухого вещества сахарозы; для приготовления 1,0 М раствора глицерина к 4 мл глицерина добавляют 36 мл ФСБ. Концы пайеты закрывают с обеих сторон пластиковыми пробками. После эквилибрации (26-30 мин) пайету, содержащую эмбрион, выдерживают 5 мин в парах жидкого азота, затем опускают в сосуд с жидким азотом.

Оттаивают пайеты в водяной бане при 37°С до исчезновения льда. Со­держимое переносят в лабораторные чашки и выдерживают в них 10 мин. При этом происходит одноступенчатое разбавление криопротектора раство­ром сахарозы. Жизнеспособные зародыши промывают 1-3 раза в растворе ФСБ с 20% -ной фетальной сывороткой теленка.

После окончания промывки эмбрионы оценивают на жизнеспособность и засасывают в стерильную пайету в такой последовательности: среда, пузы­рек воздуха, среда с эмбрионом, пузырек воздуха, среда, пластиковая пробка.

Заправленную пайету вкладывают в наконечник катетера Кассу. Гото­вый к работе прибор передают технику по пересадке эмбрионов или кладут на непродолжительное время в термостат с постоянной температурой 37° С.