НОВЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В БИОТЕХНИКЕ РАЗМНОЖЕНИЯ ЖИ­ВОТНЫХ

Трансплантация эмбрионов создает благоприятные условия для иссле­дований в области биотехники размножения животных: получение яйцекле­ток после гибели животных, оплодотворение яйцеклеток вне организма, це­ленаправленное получение двоен, регулирование пола, получение трансген­ных животных, создание химер, клонирование животных.

Культивирование овариальных ооцитов вне организма

Известно, что после разрыва фолликула в яйцепровод поступает не зрелое яйцо, а ооцит II порядка. Заключительная фаза овогенеза имеет место уже в процессе дви­жения ооцита по яйцеводу и в процессе оплодотворения. В значительной ме­ре этот процесс инициирует проникающий в цитоплазму клетки спермий. За­ключительная фаза овогенеза состоит в том, что ооцит II порядка претерпе­вает второе мейотическое деление, с образованием временного яйца и поляр­ного тела.

Незрелые ооциты выделяют из яичников коров, преждевременно вы­бывших из эксплуатации, но очень ценных в племенном отношении. Яични­ки доставляют в лабораторию в термосе с физраствором (температура 30-35°С) не позже 1,5 ч после убоя коровы или телки. Ооциты извлекают из по­лостных фолликулов, имеющих диаметр 2-5 мм, путем вымывания средой Дюльбекко с добавлением гепарина и антибиотиков). Вылавливают пасте­ровской пипеткой под микроскопом МСБ — 9 и проводят морфологическую оценку визуальным путем.

Извлеченные из фолликулов ооциты инкубируют в висячей капле, под слоем вазелинового масла при температуре 38,5°С, срок инкубации — 24 ч. Используют культуральную среду ТС-199 с добавлением 10% -ной феталь-ной сыворотки теленка и гентамицина. Для ускоренного созревания ооцита в среду добавляют гормоны: фоллитропин + лютропин и эстрадиол.

Культивирование овариальных ооцитов вне организма в перспективе может стать важным дополнительным источников эмбрионов.

Оплодотворение вне организма

Удивительное явление природы — со­единение мужской и женской половых клеток и образование новой клетки -зиготы ( в переводе с греческого -«упряжка из двух быков»), способной расти и развиваться происходит в организме матери. Английским ученым Патрику Стептоу и Роберту Эвардсу после тринадцати лет работы удалось из яйца и спермы произвести плод в колбе и пересадить его в готовом виде в матку. В 1978 г. родилась Луиза Браун — первый на земле ребенок, зачатый вне орга­низма («ребенок из пробирки»).

С 1987 г. коммерческая компания «Биотехнология животных» (Велико­британия) практикует пересадку эмбрионов от мясных телок коровам – рецепиентам в молочных стадах. Источником эмбрионов служат яйцеклетки, из­влеченные на бойне и оплодотворенные в лаборатории.

Для оплодотворения вне организма яйцеклетки необходимо провести капацитацию (созревание) спермиев. Капацитацию спермиев проводят мето­дом «swin up». С использованием среды p-TALP.

Оплодотворение ооцита капацитированными спермиями происходит в среде Fert-TALP при экспозиции 16-18 ч.

Зиготу отмывают от прилипших спермиев и переносят для дальнейшего культивирования в среду СДМ с культурой эпителиальных клеток яйцепро-вода. Срок культивирования — 144-168 ч.

Эмбрионы оценивают по морфологическим признакам, заправляют в пайеты и пересаживают коровам или телкам-реципиентам. Приживляемость составляет 20-26%. (Полянцев Н.И., Подберезный В.В., 2001).

Целенаправленное получение двоен

Метод разделения эмбрионов на ранних стадиях развития (с помощью микрохирургии) впервые был разрабо­тан и успешно апробирован на овцах датчанином С. Вилладсеном в 1979 г. Суть его заключается в следующем. Эмбрион на стадии развития в 60 клеток с помощью микроманипулятора делится на две половинки, которые поме­щают для дальнейшего развития в половые органы животного-реципиента. В результате осуществления этой операции получают двух генетически иден­тичных животных. Этот метод позволяет повысить число двоен до 70%, вме­сто 3-4% в обычных условиях.

Методика расщепления эмбрионов может быть использована для проверки молодого быка, ценность генетического потенциала которого обычно выявляется через 6-8 лет. В случае использования этого метода, одна половинка этого эмбриона сразу же вводится коровам-реципиентам, а вторая -направляется на хранение в замороженном состоянии и будет использована только после того, как станет известна потенциальная ценность генотипа данного быка.

У телок реципиентов с двойнями, как правило, не наблюдается отклоне­ний в течение стельности и в период отела. Средняя продолжительность двойневой стельности несколько меньше, чем одинцовой (258±3,4, против 278,1±3,2) дней. Двойни при рождении имеют в среднем меньшую живую массу 26,0±О,5О кг), чем одинцы (38,2±0,94кг), хотя общая живая масса двух телят всегда больше (50,8±2,58 кг).

Регулирование пола

Первые успешные опыты по регулированию пола у насекомых провел Б.Л. Астауров. Шелководам давно известно, что муж­ские коконы дают шелка процентов на 30 больше, чем женские. Применение на практике открытия Астаурова, усовершенствованного В. А. Струннико-вым, позволило увеличить выход шелка на 39%.

В практике разведения животных также очень важно научиться управ­лять образованием в потомстве мужских и женских особей. Так, если исхо­дить, из того, что бычок при потреблении одного и того же количества корма дает на 10% больше мяса, чем телка, то снижение количества телок с 50%, рождающихся в настоящее время, до примерно 20%, необходимых для поддержания поголовья стада мясного скота, позволило бы значительно увели­чить выход говядины на единицу затраченного корма. Напротив, для живот­новодов, занимающихся разведением молочного скота, важно рождение тело­чек, а не бычков.

Трансплантация двух однополых эмбрионов позволяет избежать бес­плодия (фримартинизма) телок, рождающихся в разнополых двойнях.

Уже много лет усилия ученых направлены на разделение спермиев, не­сущих X и У — половые хромосомы, чтобы влиять на соотношение полов в потомстве (центрифугирование, цитофлуорометрия, иммуногенетические способы, определение рН и др.) Однако все попытки разделения спермиев не оправдали надежд исследователей.

В связи с внедрением в практику метода трансплантации эмбрионов появилась реальная возможность решения проблемы регуляции пола на ос­нове анализа их кариотипа и удаления эмбрионов нежелательного пола. Этим методом удается правильно определить пол в 70% случаев.

В перспективе для целенаправленного получения особей желательного пола может быть применен метод микрохирургической замены X и У хромо­сом. Манипуляции с отдельными хромосомами уже проводились на растени­ях и земноводных.

Получение трансгенных животных

Метод трансплантации эмбрионов открыл широкие возможности для манипуляции с генетическим материалом. Животные, содержащие чужеродные гены, получили название трансгенных. В 1982 г. Ричарду Палмитеру, Ральфу Брикстеру и их сотрудникам /США/ удалось первыми осуществить успешный перенос гена от одного вида жи­вотных другому.

Биологи вводили чужие гены прямо в оплодотворенную мышиную яй­цеклетку при помощи капиллярной трубочки всего 1/24 000 дюйма в диамет­ре. Операцию проводили непосредственно после оплодотворения яйцеклетки на той стадии, которая называется стадией пронуклиуса, когда происходит слияние ядер яйцеклетки и спермия. Сегодня применяются и другие способы переноса генов, например электроток или вирусы.

Результатом переноса стала мышь, несущая ген гормона роста крысы, Эта трансгенная мышь — позже получившая название «сверхмышь «- прос­лавилась после того, как ее фотография появилась на обложке английского журнала «Нейчур» рядом с обычной мышью, вполовину меньшего размера.

Но главный результат опыта заключался в том, что трансгенная мышь росла в два раза быстрее, чем обычная. Есть уже и первые успехи в по­лучении трансгенных коров, овец, свиней, хотя эти работы пока очень доро­ги.

Создание химер

В древнегреческой мифологии химера — это чудовище с головой и шеей льва, туловищем козы, хвостом дракона, порождение сто­главого огнедышащего чудовища Пифона и полуженщины — полузмеи Ехид­ны. К химерам можно отнести также кентавров — лесных или горных демонов, полулюдей, полулошадей, пристрастных к вину спутников Диониса, а также сфинксов — фантастических существ с телом льва и головой человека, вопло­щенных в древнеегипетских статуях.

В средние века существовали также фантастические и наивные пре­дставления о потомстве, полученном от самых разных животных: жираф от верблюда и леопарда. Страус — от верблюда и воробья. Вполне вероятным считалось существование жюмаров (бык х кобыла, осел х корова, бык х ос­лица).

Из древнегреческой мифологии слово «химера» перешло в биологию, где оно стало обозначать организм или его часть, состоящий из генетически раз­нородных тканей, принадлежащих разным индивидуумам. Впервые этот тер­мин употребил в 1907 г. немецкий ботаник Г. Винклер для форм растений, полученных в результате сращения генетически различных клеток в один за­родыш (первичный химеризм), либо путем трансплантации тканей, перели­вания крови и т.д. (вторичный химеризм).

В 1984 г. в Кембридже (Англия) С. В. Фэбилу удалось получить потом­ство, построенное из «мозаики» клеток, часть которых несла гены одного из родителей, а часть — другого. Химерное животное (коза-овца или «ковца») унаследовало от козы рога, а от овцы — лохматую шкуру.

В 1997 г. в экспериментальном хозяйстве Дубровицы родился бык Ера­лаш, родителями которого стали, пять животных. Были использованы две ко­ровы-донора айширской и черно-пестрой породы, два быка — красной гол-штино-фризской и голландской черно-пестрой породы. Новорожденный был создан на основе конструирования генотипа на ранних эмбрионах. Вымытые из двух стельных коров эмбрионы были разделены на половинки, после чего пересажены в эмбрион, из которого удалили все содержимое. Таким образом, новый генотип несет наследственность четырех пород крупного рогатого скота. На заключительном этапе объединенный эмбрион был пересажен ко­рове- реципиенту (пятое животное), которая и родила Ералаша. Он имел бе-ло-красно-чёрную окраску. Этот бык за два с половиной года набрал вес бо­лее 700 килограммов.